自動凱氏定氮儀測定土壤有效氮
土壤有效氮包括無機的礦物態氮和易分解的、比較簡單的有機態氮,它是銨態氮、硝態氮、氨基酸、酰胺、易水解蛋白質氮的總和,通常也稱為水解氮,與全氮相比它更能反映土壤氮素近期的供應狀況,是土壤肥力的重要指標,因此是土壤的常規化驗項目之一。堿解擴散法作為傳統方法是目前測定土壤水解氮普遍采用的方法。但是該檢測方法存在明顯的設計缺陷,例如用于堿解的氫氧化鈉與硼酸吸收液處于同一個空間狹小的容器內外室中,操作過程中稍有不慎,極易發生污染;再者玻璃板和擴散皿之間可能因密封不嚴,氨氣逸出,導致測定結果偏低。為了增加結果的可靠性,常常要做3個平行樣,這無疑又增加了工作量。簡而言之,該法費時費力,工作效率低下,與當前快速、準確的檢測要求相差甚遠。隨著現代儀器的迅速發展,許多研究人員提出采用自動凱氏定氮儀進行土壤水解性氮/堿解氮的測定。毋容置疑,自動凱氏定氮儀用于土壤水解性氮的測定,簡便、快速、精密度高,這是由儀器本身的性能決定的。
自動凱氏定氮儀測定的土壤堿解氮是否是傳統意義上的堿解氮。目前,土壤有效氮的測定方法主要有生物培養法、酸水解法、堿水解法,其中堿水解法由于適用范圍廣更適合于例行分析。堿水解法有堿解擴散法和堿蒸餾法2種,傳統的堿解蒸餾法:蒸餾時間為8min,加熱蒸餾裝置落后,需人為經驗控制,操作煩瑣。因此應用普及程度遠低于堿解擴散法。隨著現代儀器的迅速發展,許多研究人員提出采用自動凱氏定氮儀進行土壤堿解氮的測定,實際上自動凱氏定氮儀用于測定土壤堿解氮是對傳統堿解蒸餾法的改進方法。
圖1傳統的堿解蒸餾裝置
由表1可以看出,目前公開發表的文獻中,自動凱氏定氮儀測定土壤水解性氮/堿解氮的幾個關鍵參數設定不一致,比如起水解作用的氫氧化鈉濃度、蒸餾效率、蒸餾時間等,但實驗結論基本一致,即新堿解蒸餾法與堿解擴散法測定的土壤水解性氮含量相同,自動凱氏定氮儀可以用于測定土壤堿解氮。原因何在?是測定不同的土壤樣品需要不同的實驗條件嗎?文獻的實驗土壤樣品均有國標土樣GBW07414a,但氫氧化鈉起始濃度分別為4.44、6.67mol/L、稍微小于4.0mol/L(因為用少許蒸餾水沖洗粘在內壁上的樣品),很顯然,同一個土壤樣品,不同的實驗條件,得出了相同的實驗結果。而研究結果表明,氫氧化鈉的濃度對其測定結果影響很大,其濃度過低,易水解蛋白質水解不全部溶解,檢測結果偏低;其濃度過高,某些難水解蛋白質發生部分水解,導致結果偏高。
表1公開發表文獻中的實驗條件及實驗結論
供試土壤為設施栽培土壤,采自西藏林芝河谷地區,成土母質多為洪積沖積物,土壤質地較砂,保水保肥性差,共16個土壤樣品。
表2供試土壤樣品相關理化指標的統計值
新堿解蒸餾法的測定步驟：使用儀器為意大利產VELP自動凱氏定氮儀UDK169型,儀器調試過程:將標定濃度為0.0355mol/L的鹽酸溶液、10mol/L的氫氧化鈉、硼酸指示劑混合溶液、蒸餾水裝入相應的容器,按正常程序開機和儀器自檢。考慮到土壤樣品和高原測定條件的相似性,參考文獻來設置儀器參數(硼酸接收液30mL,4.0mol/L的氫氧化鈉20mL,蒸汽強度50%,蒸餾時間4min),空蒸3根蒸餾管以清洗管道,然后進行空白樣測試,空白樣消耗鹽酸體積為0.067mL,并用分析純硫酸銨做儀器回收率測試,測試結果為99.8%,儀器調試結束。
土壤樣品的測定:(1)稱取通過1mm篩的風干土樣2.00g置于蒸餾管中,土壤樣品蒸餾時設置2個處理:加入1g鋅-硫酸亞鐵還原劑和不加鋅-硫酸亞鐵還原劑。同時做相應的空白測定。(2)將內盛土壤樣品的蒸餾管連接在定氮儀上,旋緊接口,開始蒸餾,儀器自動完成后續的蒸餾和滴定過程,滴定完成后,記錄下土壤樣品消耗鹽酸的體積,取下蒸餾管。
堿解擴散法的測定步驟：
(1)稱取通過1mm篩的風干土樣2.00g,均勻平鋪于擴散皿外室。土壤樣品堿解時設置2個處理:加入0.2g的FeSO4·7H2O和0.1mL的飽和AgSO4溶液;不加還原劑FeSO4·7H2O和催化劑AgSO4。
(2)在擴散皿內室加入2mL的20g/L硼酸—指示劑溶液,在皿的外室邊緣涂上堿性膠液,蓋上毛玻璃,旋轉數次,使皿邊與毛玻璃基本都黏合。
(3)再慢慢轉開毛玻璃的一邊,使擴散皿外室露出一條狹縫,迅速加入10mL的NaOH溶液于外室(加還原劑的外室加1.07mol/L的NaOH溶液,不加還原劑的外室加1.0mol/L的NaOH溶液),立即蓋嚴,水平地輕輕轉動擴散皿,使NaOH溶液蓋住所有土壤。然后用橡皮筋圈緊,使毛玻璃固定。
(4)隨后小心平放在(40±1)℃恒溫培養箱中,(24±0.5)h后取出,用0.005mol/L的HCl標準溶液(按照GB/T601—2016進行準確標定,實際標定濃度為0.0051579mol/L)滴定內室中硼酸所吸收的氨量,內室硼酸吸收液由藍色變為微紅色即達滴定終點。
每個樣品做3次重復測定。在樣品測定的同時進行空白實驗。
試驗結果與分析
2種方法測定結果的比較：由表3可知,堿解氮因測定方法不同測得的結果亦不同。2種測定方法的差異性檢驗結果顯示,在不加還原劑的情況下,除了8號和12號樣外,新堿解蒸餾法的測定值均顯著低于堿解擴散法;在加還原劑的情況下,新堿解蒸餾法一部分樣品的測定值低于堿解擴散法,一部分樣品的測定值高于堿解擴散法,有75%的土壤樣品呈顯著性差異。鑒于堿解擴散法為測定土壤堿解氮的傳統經典方法,采用堿解擴散法測定值為基準,計算得出加與不加還原劑時,2種方法測定值相對相差的平均值分別為11.03%和21.35%。這說明,在本研究設定的試驗參數條件下,自動定氮儀測定土壤堿解氮含量時,至少被低估了10%～20%以上。
2種方法測定結果的相關性分析：總體上,無論加與不加還原劑,2種方法測定的堿解氮含量間均存在極顯著的線性相關關系(P<0.0001),總體決定系數R2分別高達0.943和0.918,2種方法的堿解氮測定結果高度相關。雖然2種方法測定結果之間呈現顯著性差異,但并沒有影響2種方法測定結果的相關性,這在某種程度上說明了自動凱氏定氮儀用于測定土壤堿解氮的適用性和可行性。
同一種測定方法加與不加還原劑的差值與硝態氮含量之間的相關性分析：在測定土壤堿解氮時,如果要將土壤中硝態氮包括在內,需要添加還原劑進行還原。理論上講加與不加還原劑測定結果之間的差值即為土壤硝態氮含量。現在把2種方法測定的加與不加還原劑的差值與土壤硝態氮含量(酚二磺酸比色法測定)進行線性擬合,由圖3可以看出新堿解蒸餾法的擬合結果明顯優于堿解擴散法,表明用自動凱氏定氮儀測得的加與不加還原劑的差值和硝態氮的含量相關程度更高,自動凱氏定氮儀測定的土壤硝態氮與真值更為接近。
表3不同測定方法測定土壤堿解氮的測定結果比較
注:同一樣品,同行不同字母標示差異顯著(P<0.05)。
圖2自動定氮儀測定值與堿解擴散法測定值的相關性
結論
自動凱氏定氮儀用于土壤堿解氮的測定,與傳統的堿解擴散法相比,堿解條件堿解時間不同,因此從概念上講,自動凱氏定氮儀測定的“土壤堿解氮”不同于堿解擴散法測定的“土壤堿解氮”。試驗結果表明,無論加與不加還原劑,75%以上的土壤樣品具有顯著差異性,這進一步驗證了2種方法測定的土壤堿解氮數量上不同,因此自動凱氏定氮儀測定的“土壤堿解氮”不能等同于堿解擴散法測定的“土壤堿解氮”。但是自動凱氏定氮儀測定值與傳統方法之間呈極顯著相關關系,且測得的加與不加還原劑的差值和硝態氮的實際含量相關程度更高,這表明自動凱氏定氮儀測定的土壤堿解氮結果具有一定的現實意義,結合其操作簡便、分析效率高的優點,因此自動凱氏定氮儀測定的“土壤堿解氮”可作為不同于傳統意義上的“土壤堿解氮”的一個新測定指標,應用于生產實踐。
圖3加與不加還原劑的差值與硝態氮含量之間的相關性
